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探讨运动训练促进SCI修复的可能机制

时间:2014-08-25 来源:未知 作者:小韩 本文字数:3204字
论文摘要

  脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是脊柱损伤最严重的并发症,可导致损伤节段以下严重的运动、感觉及自主功能障碍,给患者带来严重的身心伤害,也给社会造成巨大的经济负担。针对SCI的早期治疗与临床康复已成为当今医学领域的一大课题。运动训练作为康复治疗的重要手段,广泛用于SCI患者的临床康复,其疗效也被大量研究所证实。运动训练促进SCI修复的神经生物学机制仍不十分清楚。

  神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)是一种具有神经元营养及促进突起生长双重生物学功能的多肽因子,对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均起着重要作用。本研究在前期建立胸段脊髓打击损伤大鼠模型基础上,通过观察运动训练对SCI大鼠脊髓内NGF及其酪氨酸激酶受体 A (Tyrosine kinase receptor A,TrkA)表达的影响,探讨运动训练促进SCI修复的可能机制,为脊髓损伤的康复治疗提供实验依据。

  1 材料与方法

  1.1 实验动物及分组 健康成年雌性 SD 大鼠24 只,体重(225±25) g,购自南方医科大学动物中心。将其随机分为假手术组(n=6)、损伤对照组(损伤后不训练,n=9)和运动训练组(术后1周开始训练,共4 周,n=9)。

  1.2 大鼠 SCI 模型制备 10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后,切除T10椎板,暴露脊髓。采用通用型脊髓打击器(由中山大学脊髓损伤研究所提供)制备脊髓损伤模型。围手术期肌注青霉素20万IU/kg预防感染,连续3 d;并定时进行膀胱按摩,协助排便。

  1.3 运动训练 损伤一周后开始运动训练,每天两次,每次 10 min,每周连续训练 5 d,共训练 4周。减重平板训练采用专用跑步机及减重装置。跑台速度为0.8 km/h。减重量为体重的20%~40% (随时间延长逐渐降低减重程度,第1周减重40%,第2周35%,第 3 周 30%,第 4 周 20%)。对照组置于笼内不进行任何康复运动训练。

  1.4 运动功能评定 应用脊髓运动功能行为学评分BBB法观察SCI大鼠后肢功能恢复情况。完全截瘫为0分,正常为21分。得分越高,表明运动功能越好。损伤前及损伤后1、2、3、4、5周分别由两名熟悉BBB评分标准的研究人员进行盲法评分。

  1.5 脊髓标本取材 运动训练结束后(即损伤后5周),10%水合氯醛腹腔内注射麻醉,4%多聚甲醛磷酸缓冲液灌注固定后,取大鼠T12~L1节段脊髓,经固定、脱水、透明及石蜡包埋。假手术组和损伤对照组均在术后5周取材。

  1.6 免疫组织化学检测 标本经固定后制成5 μm 厚的石蜡切片,按 PV-9000 试剂盒(美国 GBI 公司)说明进行免疫组织化学二步法染色。光学显微镜下观察切片中组织染色、NGF及TrkA蛋白的表达分布情况。

  1.7 Western blot 检测 取脊髓组织充分研磨后抽提总蛋白,BCA法蛋白定量后,将30 μg蛋白样本经 10%SDS-PAGE 电泳分离,再转印至 PVDF 膜上。用含 5%脱脂奶粉的 TBST 封闭 2 h,加入 NGF和 TrkA 一抗 4℃孵育过夜,洗膜,再用辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h。ECL化学发光系统检测蛋白信号。

  1.8 统计学方法 采用 SPSSl6.0 统计软件对数据 进 行 统 计 学 分 析 ,采 用 单 因 素 方 差 分 析 法(ANOVE)对组间差异进行统计,P<0.05 为差异有统计学意义。

  2 结 果

  2.1 运动功能检测结果 运动训练组和损伤对照组的BBB评分自损伤后第2周开始升高,损伤后第3~5 周时仍呈增加趋势,运动训练组较损伤对照组增加更明显,但两组BBB评分均低于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05)。自损伤后第3周(即运动训练两周)起,运动训练组BBB评分高于损伤对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。【表1】
论文摘要

  2.2 NGF 免疫组化检测结果 NGF 免疫反应阳性产物多分布于脊髓前角的神经元内,脊髓后角及中央管周围也有出现。运动训练组NGF阳性染色颗粒明显增多(见图1),其平均光密度值较假手术组及损伤对照组增加,差异有统计学意义(P<0.05),见图2。【图.略】
  
  2.3 TrkA 免疫组化检测结果 TrkA 免疫反应阳性产物于脊髓前角、后角、中央管周围处均出现较多分布。运动训练组TrkA阳性染色颗粒增多见图3,其平均光密度值较假手术组及损伤对照组增加,差异有统计学意义(P<0.05),见图4。

  2.4 Western blot 检测结果 运动训练组大鼠脊髓内NGF和TrkA的表达比假手术组及损伤对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),见图5。【图.略】
  
  3 讨 论
  
  临床研究表明,恰当的康复运动训练能够促进SCI 患者肢体运动和感觉功能的恢复,但其神经生物学分子基础尚不十分清楚。本研究通过建立SCI大鼠模型,观察运动训练对SCI大鼠肢体运动功能的影响。BBB评分是SCI实验研究中评价脊髓功能的一项重要指标,广泛应用于SCI大鼠后肢运动功能的评估。本实验结果显示,SCI后第1周各组BBB评分均在4分以下,随着时间的推移BBB评分逐渐增高,在SCI后前2周,对照组、运动训练组BBB评分并无显着差异,这与其他学者的研究结果相一致。在SCI 后第 3~5 周时运动训练组 BBB 评分显着高于对照组,提示运动训练可促进SCI大鼠运动功能恢复。

  NGF 是神经系统内一类可促进和维持神经元生长、分化并影响突触可塑性的重要生物活性物质。大量研究已证实,NGF在形态、结构和功能等多方面影响神经元的分化,NGF不仅刺激神经元胞体增大、诱导突起生长并促进树突发育,调控着神经分化相关功能蛋白的表达与修饰;而且NGF还能够促进受损中枢神经纤维生长新的轴突,与原来的靶细胞建立新的突触联系。体外培养 PC12 细胞发现,加入NGF1~2 d 后 PC12 细胞可延伸出较短的神经突起。

  本研究发现,运动训练组SCI大鼠脊髓内NGF表达较对照组明显增加,表明运动训练可促进大鼠脊髓内NGF 表达。提示运动训练可能通过增加脊髓内 NGF表达来促进受损神经纤维的轴突再生,从而促进SCI大鼠运动功能恢复。

  目前认为,NGF所具备的促使成熟神经元重塑的能力,有赖于NGF与其受体TrkA的结合。NGF受 体分为高亲和力受体 TrkA 和低亲和力受体P75NTR,其中 TrkA 被认为是 NGF 主要的功能受体。

  NGF与TrkA结合后,可启动多种途径以促进神经元存活。对大鼠皮质注射NGF后,能够挽救因单眼剥夺诱导皱缩的外侧膝状体核神经元,并加速神经元的生长,这一作用依赖于大鼠皮质内TrkA的活化。NGF诱导的TrkA磷酸化能防止兴奋性氨基酸毒性作用引起的细胞凋亡。此外,TrkA不仅启动促进细胞存活的信号,同时还抑制P75NTR启动的死亡信号。本实验发现,运动训练组大鼠脊髓内TrkA的表达较对照组明显增加,表明运动训练可增强损伤脊髓处TrkA 蛋白的表达。其可能机制是 NGF 通过诱导TrkA 磷酸化进而激活 TrkA 通路,从而促进 SCI 大鼠运动功能恢复。提示NGF/TrkA途径可能参与了运动训练促进SCI修复过程,可能是康复运动促进SCI修复的重要机制。

  综上所述,本研究显示运动训练可增加SCI后脊髓内NGF及其受体TrkA的表达,促进SCI大鼠运动功能恢复。由此推测,运动训练可能是通过刺激NGF及TrkA的表达增加,激活NGF/TrkA途径,从而创造出有利于神经再生的微环境,促进脊髓损伤修复。

  参 考 文 献
  
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